2025版中國藥典0722維生素D測定法內(nèi)容介紹
更新時(shí)間：2025-12-18 | 點(diǎn)擊率：12
本法系用高效液相色譜法（通則0512）測定維生素D（包括維生素D2和維生素D3，下同）及其制劑、維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經(jīng)折算成維生素D的總量，以單位表示，每單位相當(dāng)于維生素D 0.025μg。測定應(yīng)在半暗室中及避免氧化的情況下進(jìn)行。無維生素A醇和其他成分干擾的供試品可用第一法測定，否則應(yīng)按第二法處理后測定；如果按第二法處理后，前維生素D峰仍受雜質(zhì)干擾，僅有維生素D峰可以分離時(shí)，則應(yīng)按第三法測定；存在維生素A醇和其他成分干擾的供試品也可按第四法測定。對(duì)照品貯備溶液的制備 根據(jù)供試品中所含維生素D的成分，取相應(yīng)的維生素D2或D3對(duì)照品約25mg，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加異辛烷80ml，避免加熱，超聲處理1分鐘使完quan溶解，用異辛烷稀釋至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作為貯備溶液（1）；精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用異辛烷稀釋至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作為貯備溶液（2）。測定維生素D2時(shí)，應(yīng)另取維生素D3對(duì)照品25mg，同法制成維生素D3對(duì)照品貯備溶液，供系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用硅膠為填充劑；以正己烷-正戊醇（997∶3）為流動(dòng)相；檢測波長為265nm。量取維生素D3對(duì)照品貯備溶液（1）5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加熱1小時(shí)，取出，迅速冷卻，加正己烷5ml，搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波長分別為254nm和365nm的紫外光燈下，將石英吸收池斜放成45°并距燈管5～6cm，照射5分鐘，使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3；量取該溶液10μl注入液相色譜儀，進(jìn)樣5次，記錄峰面積，維生素D3峰的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；前維生素D3峰（與維生素D3峰相對(duì)保留時(shí)間約為0.5）與反式維生素D3峰（與維生素D3峰相對(duì)保留時(shí)間約為0.6）以及維生素D3峰與速甾醇D3峰（與維生素D3峰相對(duì)保留時(shí)間約為1.1）之間的分離度均應(yīng)大于1.0。供試品溶液的制備 取該品種項(xiàng)下制備的供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備 精密量取對(duì)照品貯備溶液（1）或貯備溶液（2）5ml，置50ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。測定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各50～200μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法，以峰面積，照下列公式計(jì)算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量（ci）。式中 c1為對(duì)照品溶液的濃度，μg/ml；A1為對(duì)照品溶液色譜圖中維生素D峰的峰面積；F為前維生素D相對(duì)于維生素D的校正因子，以2.25計(jì)；如各論項(xiàng)下檢測波長為254nm，F值為2.05。供試品溶液A的制備 取供試品適量（相當(dāng)于維生素D總量600單位以上，重量不超過2.0g），精密稱定，置皂化瓶中，加乙醇30ml、維生素C 0.2g與50%氫氧化鉀溶液3ml[若供試量為3g，則加50%氫氧化鉀溶液4ml]，置水浴上加熱回流30分鐘，冷卻后，自冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內(nèi)壁，將皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分?jǐn)?shù)次洗滌，洗液并入分液漏斗中，用不含過氧化物的乙mi振搖提取3次，第一次60ml，以后每次40ml，合并乙mi液，用水洗滌數(shù)次，每次約100ml，洗滌時(shí)應(yīng)緩緩旋動(dòng)，避免乳化，直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色，靜置，分取乙mi提取液，加入干燥濾紙條少許振搖除去乙mi提取液中殘留的水分，分液漏斗及濾紙條再用少量乙mi洗滌，洗液與提取液合并，置具塞圓底燒瓶中，在水浴上低溫蒸發(fā)至約5ml，再用氮?dú)饬鞔蹈?，迅速精密加入甲?ml，密塞，超聲處理助溶后，移入離心管中，離心，取上清液作為供試品溶液A。凈化用色譜系統(tǒng)分離收集維生素D 精密量取上述供試品溶液A 500μl，注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱，以甲醇-乙腈-水（50∶50∶2）為流動(dòng)相進(jìn)行分離，檢測波長265nm，記錄色譜圖，維生素D與前維生素D應(yīng)為重疊峰，并能與維生素A及其他雜質(zhì)分開。準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，置具塞圓底燒瓶中，用氮?dú)饬餮杆俅蹈桑芗尤胝和槿芤哼m量，使每1ml中含維生素D 50～140單位，密塞，超聲處理使溶解，即得供試品溶液B。對(duì)照品溶液的制備 精密量取第一法的對(duì)照品貯備溶液（2）5ml，置50ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。測定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液B各100～200μl，照第一法進(jìn)行含量測定。供試品溶液的制備 取該品種項(xiàng)下制備的供試品溶液A，按上述第二法凈化用色譜系統(tǒng)分離收集維生素D項(xiàng)下的方法處理，至“用氮?dú)饬餮杆俅蹈?后，加入異辛烷2ml溶解，通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中，加熱1.5小時(shí)后，立即通氮在2分鐘內(nèi)吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即得供試品溶液C。對(duì)照品溶液的制備 精密量取第一法的對(duì)照品貯備溶液（1）適量，加異辛烷定量稀釋制成每1ml中約含維生素D 50單位的溶液，精密量取2ml，置具塞圓底燒瓶中，照供試品溶液制備項(xiàng)下的方法，自“通氮排除空氣后"起，依法操作，即得對(duì)照品溶液。測定法 照第一法項(xiàng)下的色譜條件，精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液C各200μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算維生素D的含量。供試品溶液的制備 取供試品適量（相當(dāng)于維生素D總量500單位），精密稱定，置25ml棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備 精密量取第一法的對(duì)照品貯備溶液（1）5ml，置50ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，精密量取2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。定位溶液的制備 量取第一法的對(duì)照品貯備溶液（1）5ml，置50ml棕色量瓶中，加2，6-二叔丁基對(duì)甲酚結(jié)晶1粒，通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中加熱1.5小時(shí)，取出，迅速冷卻，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為定位貯備溶液；取定位貯備溶液2ml，置100ml棕色量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為前維生素D峰和維生素D峰定位溶液。系統(tǒng)適用性溶液的制備 量取上述定位貯備溶液和供試品溶液各5ml混勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 檢測波長265nm，柱溫40℃，流速為每分鐘0.5ml。收集管為聚醚醚酮（Peek）管，內(nèi)徑0.0762cm（0.03英寸），20m，容積約9ml。第一維液相色譜：以脲基鍵合硅膠為填充劑（Urea group, 2.1mm×150mm, 3μm，或其功能類似填料的色譜柱）；以正己烷為流動(dòng)相A，以正己烷-正戊醇-異丙醇（98∶1∶1）為流動(dòng)相B，按下表程序進(jìn)行梯度洗脫。第二維液相色譜：以硅膠（3mm×100mm, 1.8μm）為填充劑；以正己烷-正戊醇-異丙醇（996∶2∶2）為流動(dòng)相。量取定位溶液100μl注入第一維液相色譜儀，對(duì)前維生素D峰和維生素D峰進(jìn)行定位。調(diào)節(jié)第一維液相色譜流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的初始比例使維生素D主峰的保留時(shí)間約25分鐘，第一維液相色譜中前維生素D切換時(shí)間設(shè)為前維生素D峰保留時(shí)間的前后各約1.5分鐘；第一維液相色譜中維生素D切換時(shí)間設(shè)為維生素D出峰開始時(shí)間前和出峰完畢時(shí)間后各約1.5分鐘；量取系統(tǒng)適用性溶液100μl注入液相色譜儀，第一維液相色譜系統(tǒng)中前維生素D峰與維生素D峰之間的分離度應(yīng)不小于5，理論板數(shù)按維生素D峰計(jì)算應(yīng)不低于2300；第二維液相色譜系統(tǒng)中維生素D峰與相鄰峰之間的分離度以及前維生素D峰與相鄰峰之間的分離度均應(yīng)符合規(guī)定。測定法 精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各100μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按第一法的計(jì)算方法計(jì)算，即得。【附注】高效液相色譜儀需要雙泵、雙通道、雙紫外檢測器。一般情況下選用六通閥即可完成方法的切換過程，六通閥連接如圖1所示。
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